（报告出品方/作者：太平洋证券，盛丽华）
一、mRNA疫苗生产可分为两大块：mRNA制备和脂质微粒进行包封
mRNA疫苗生产可分为两大块，可以类比为“原料药”（mRNA）的生产和纯化，以及“制剂”（利用脂质微粒进行包封）阶段。原料药（mRNA）生产涉及DNA原液制备和mRNA原液的制备，mRNA原液的制备（体外转录），是整个mRNA工艺流程中核心的步骤，而原料主要是酶。
(一)mRNA疫苗的生产
mRNA疫苗生产可分为两大块，原料药（mRNA）的生产以及制剂（利用脂质微粒进行包封）阶段。mRNA生产涉及DNA原液制备和mRNA原液的制备。所以mRNA疫苗的生产可分为三大阶段，第一步DNA原液制备，第二步mRNA原液的制备，第三步是利用脂质微粒进行包封。
第一步：DNA模板生产，主要是质粒生产。编码抗原的DNA模板生产，常用大肠杆菌大规模体内表达，最后提取和纯化携带目的序列的质粒；
第二步：mRNA原液的制备，转录，由DNA到mRNA。在无细胞的反应器内进行转录，通过T7、SP6或T3等RNA多聚酶作用，通过一步或者两步法转录成为mRNA，同时加上5’的Cap及3’的PolyA尾巴，在进一步使用DNA酶将残留的DNA模板进行消除；纯化，使用离子交换等层析步骤进一步将转录形成的mRNA进行纯化，进行超滤浓缩形成原液；
第三步：制剂阶段，利用脂质微粒进行包封。通过微流体泵精确地控制着mRNA原液和脂质流速，将他们混合成脂质纳米粒LNP。最后则是成品的灌装及质量控制，贴签形成终产品。
二、mRNA合成过程所需原料及成本测算
（一）国内外mRNA新冠疫苗的合成工艺
BioNTech/辉瑞、Moderna和艾博生物mRNA疫苗的合成工、艺如下：
1）BNTb2–BioNTech/辉瑞
三核苷酸cap1类似物（（m27,3′-O）Gppp（m2-O）ApG）（TriLink）和N1-甲基假尿苷-5′-三磷酸（m1ψTP）（ThermoFisherScientific）取代尿苷-5′-三磷酸（UTP）的存在下，通过T7RNA聚合酶对DNA进行纯化和体外转录。
总结：转录采用一步法，帽子类似物作引物；甲基假尿苷取代尿苷。
2）mRNA-–Moderna
利用优化的T7RNA聚合酶介导的转录反应在体外合成了编码序列优化的mRNA，尿苷被N1-甲基假尿苷完全取代。转录后，使用牛痘苗封盖酶（新英格兰生物实验室）和痘苗2′O-甲基转移酶（新英格兰生物实验室）将Cap1结构添加到5’端。通过oligodT亲和纯化纯化mRNA，通过切向流过滤将缓冲液交换到pH为5.0的醋酸钠中，无菌过滤，并在-20°C下冷冻，直到进一步使用。
总结：转录采用两步法，需要加帽酶的参与，甲基假尿苷取代尿苷。
3）ARCoV-艾博生物
该mRNA在体外使用T7RNA聚合酶介导的转录从质粒ABOP-（GENEWIZ）的线性化DNA模板中产生，该质粒编码SARS-CoV-2的密码子优化RBD区域，并包含5’和3‘的未翻译区域（UTR）和一条poly-a尾巴，以未修饰的NTP作为原料和T7聚合酶体外进行mRNA的合成，使用了牛痘加帽系统（VacciniaCappingSystem）(Novoprotein)进行加帽。
总结：转录采用两步法，需要加帽酶的参与。
（二）mRNA制备过程原料
mRNA制备过程需要用到的主要原料包括质粒DNA模板、一系列酶（主要为7种酶）以及底物核苷酸等;
1、模板DNA所需原料：质粒
DNA模板生产，主要是质粒的生产。编码抗原的DNA模板，通过质粒转染到大肠杆菌大规模体内表达，最后提取和纯化携带目的序列的质粒，即得到DNA模板。目前质粒的生产提取和纯化工艺很成熟，可以自建生产线或者外包出去，例如辉瑞自建质粒生产工厂，大部分mRNA企业外包，Moderna和国内企业目前是外包。
制备mRNA质粒的要求：质粒用于制备mRNA，这类DNA本身不属于API，DNA需要按照GMP规范进行，GMP质粒要求生产设备必须是专用的、符合GMP规范且配备洁净间。
2、mRNA体外转录所需原料：一系列酶+核苷酸底物
mRNA疫苗的研发与生产需要一系列酶的参与：mRNAT7聚合酶、无机焦磷酸酶、RnaseInhibitor、加帽酶以及2′O-甲基转移酶、Poly(A)聚合酶和DNAase等主要7种酶。
2.1转录过程所需要的酶
RNA聚合酶体系：RNA聚合酶是体外转录mRNA的关键酶。
T3、T7和SP6RNA聚合酶分别对T3、T7和SP6噬菌体启动子具有高度的特异性。将目的基因序列克隆到T7和SP6启动子下游的多克隆位点中，以克隆的DNA为模板体外合成相应的RNA。
T7RNAPolymerase（T7RNA聚合酶）高度特异识别T7启动子序列，以含有T7启动子序列的单链或双链DNA为模板，以核甘酸（NTP）为底物，合成与启动子下游的单链DNA互补的RNA。
无机焦磷酸酶：加入无机焦磷酸酶，增加RNA产量。无机焦磷酸酶（PPase）可催化无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐，可以为蛋白、RNA和DNA的生物合成反应提供动力，促进产物的生成。在工业化生产mRNA疫苗的时候会产生大量的无机焦磷酸盐，为了保证mRNA疫苗高效生产，可以添加无机焦磷酸酶，可解除生成的无机焦磷酸盐对反应体系的抑制。
RNase抑制剂：防止RNA的降解。少量RNase在RNA制备过程中引入，会导致RNA的降解，污染可能通过实验过程中使用的枪头、试管（离心管）和其他试剂引入。通常使用RNase抑制剂作为减少和控制此类污染物的预防措施。
RNase抑制剂能与RNaseA形成1:1复合体，抑制RNase活性，在mRNA疫苗研发和生产过程需要保持mRNA的稳定性以保证疫苗高质量的生产。
2、转录所需材料-核苷酸和修饰核苷酸
mRNA疫苗研发中常进行假尿嘧啶化修饰，尿嘧啶修饰是最丰富的RNA修饰，一般由尿苷的异构化产生，mRNA的假尿嘧啶化修饰主要有三个功能：改变密码子、增强转录本稳定性和应激反应应答。
3、加帽和加尾：共转录加帽/模板加尾，转录后加帽/加尾
真核生物体内会对转录形成的mRNA进行加帽，即在mRNA的5’端添加一个甲基化的鸟苷酸帽子（m7GPPPN结构），从而保护mRNA免遭核酸外切酶的攻击以增加mRNA的稳定性，并且协助mRNA与核糖体的结合以促进翻译起始。生物体内的帽子结构有cap0，cap1，cap2三种形式，牛痘病毒加帽酶能够在mRNA的5’端添加cap0帽子，再使用甲基转移酶处理即可得到cap1帽子。
此外，5帽子还参加mRNA前体的剪接，参与mRNA3末端多聚腺苷酸化，保证mRNA在细胞质中的稳定运输。
加帽需要的酶：牛痘病毒加帽酶
可以将7-甲基鸟苷帽结构（m7Gppp，Cap0）加到RNA的5末端，大幅提高mRNA的稳定性和启动mRNA的翻译。牛痘病毒加帽酶能够在一小时之内对mRNA进行加帽，效率接近%。
在mRNA疫苗研发生产过程中，mRNA加帽效率和加帽mRNA稳定表达的效率对疫苗的工业化生产有重大的影响。牛痘病毒加帽酶体系加帽的mRNA在细胞内的表达效率大于帽子类似物mRNA的表达效率。
加尾酶：Poly(A)聚合酶
Poly(A)聚合酶可以催化ATP以AMP的形式依次掺入到RNA的3末端，即在RNA的3末端加多聚A尾。Poly(A)尾巴能够增强mRNA的稳定性、提高翻译起始效率、引导mRNA出核。
主要用到的酶：
1）牛痘病毒加帽酶：
2）痘苗2′O-甲基转移酶
3）Poly(A)聚合酶
加帽酶非常昂贵，如何替代加帽酶？
一步法合成mRNA疫苗产品的加帽可以在mRNA的体外转录过程中通过掺入“帽子序列”实现，这种加帽技术会将加帽序列反向加在mRNA上，在反应体系中加入5’帽类似物，可以省一个加帽酶，以及减少纯化步骤，一定程度上降低成本（尤其是节省了昂贵的加帽酶成本），但相对应地，产量较之两步法（加帽酶参与）减少，因为加帽酶的加帽效率更高。
4、消除DNA模板：需要DNA酶
合成后的产物可能会有DNA残留，在疫苗开发阶段，残留的去除是关键的步骤，以减少下游纯化难度并增加产品的纯度。需要用DNA酶（DNAase将残留的DNA模板进行消除，在mRNA疫苗生产的过程中对DNA的残留控制非常严格。
（三）mRNA制备过程原料成本测算
1、DNA模板或者质粒成本：以ugmRNA所需成本为计（考虑质粒生产外包的情况下）
测算假设如下：
1）从质粒DNA酶切到模板，预计占比30%左右，预计在1mg质粒到DNA模板是ug；
2）质粒生产价格，参考金斯瑞